许晶虹教授：结直肠癌的分子检测与进展

24-05-30 肿瘤瞭望消化时讯

编者按：近日，在结直肠功能重建质量控制与创新论坛上，浙江大学医学院附属第二医院许晶虹教授做了题为“结直肠癌的分子检测与进展”的报告。《肿瘤瞭望-消化时讯》现将报告内容整理如下，以飨读者。

结直肠癌的分子检测的意义

结直肠癌是我国常见恶性肿瘤，据国家癌症中心最新发布的相关数据显示，我国结直肠癌的发病率约为28/10万人，仅次于肺癌和胃癌。近年来，免疫治疗和基于分子标志物的靶向药物治疗明显延长了结直肠癌患者的生存期，常规开展病理分子检测，不仅有利于筛选出适合接受免疫治疗和靶向治疗的患者，以提高其生存率，还可以帮助进行结直肠癌的分子分型，对个体治疗方案制订、疗效预测及预后评估有重要作用。

2024 CSCO指南提出所有初诊初治的结直肠癌均应进行MMR/MSI状态评估。RAS/BRAF突变检测在行根治术的患者是Ⅱ级推荐，在晚期转移性结直肠癌是Ⅰ级推荐。后线患者推荐进行更多基因检测，如HER2、NTRK等，今年新增了POLE/POLD1检测的Ⅲ级推荐，目的是为后线患者寻找更多靶向治疗和免疫治疗的机会。

2024年v1版NCCN指南也提出，对于疑似或者明确为转移性结直肠癌的分子标志物检测，除了常规的RAS、BRAF、HER2、MMR/MSI之外，还需将如POLE/POLD1、RET和NTRK等可诉性突变和融合检测纳入其中。并且删除“已经明确RAS或者RAF突变不再需要进行HER2检测”，改为“基于组织和血液的二代测序（NGS）panel能够发现罕见且可诉性突变和融合”，突出NGS的检测优势。

结直肠癌常用的分子检测

1.MMR蛋白表达/MSI检测

MMR蛋白表达/ MSI状态是包括结直肠癌在内的泛瘤种免疫检查点抑制剂疗效的预测指标。目前检测MMR/MSI的方法主要有三种，分别为免疫组织化学（IHC）、聚合酶链式反应（PCR）、NGS。

MMR蛋白表达主要通过IHC检测，一般检测4个常见MMR蛋白（MLH1、MSH2、MSH6和PMS2），正常表达呈细胞核阳性。任何1个蛋白出现核不表达，肿瘤为dMMR（错配修复功能缺陷），多为MSI-H；所有4个蛋白均核表达，则为pMMR（错配修复功能完整）。IHC便宜易行，但检测4个MMR蛋白有局限性，有可能漏掉其他MMR蛋白的缺失，而且由于肿瘤的异质性，整个肿瘤的评估有可能存在不一致。

PCR+毛细管电泳法是MSI检测的“金标准”，通常对5个微卫星位点（如“BAT25，BAT26，D2S123，D5S346和D17S250”或“BAT25，BAT26，NR21, NR24, MONO27”等）进行检测，超过30%（5个位点中≥2个）的微卫星位点不稳定为微卫星高度不稳定（MSI-H），少于30%（1个位点）为微卫星低度不稳定（MSI-L），没有位点出现不稳定则为微卫星稳定（MSS）。PCR能够客观地评估MSI状态，但是对实验室条件要求较高，价格也相对高些。

研究显示，MMR-IHC与MSI-PCR结果具有90%~97.5%的一致性，即dMMR相当于MSI-H, pMMR相当于MSI-L或MSS。但由于两种方法的检测原理不同，MMR染色异质性、MMR系统的功能补偿机制、MMR基因错义突变以及化疗等原因均可能导致MSI与MMR结果不一致。当MMR与MSI检测结果不一致时，美国病理学家学会（CAP）专家建议首先需要复阅排除判读解释错误，必要时可进行重复检测或附加检测方法。《结直肠癌及其他相关实体瘤微卫星不稳定性检测中国专家共识》也指出，可考虑采用第3种方法（NGS或PCR法）进行验证（部分专家推荐）。

随着高通量测序平台的广泛应用，NGS平台目标区域测序（即NGS panel）或全外显子组测序（WES）/全基因组测序（WGS）开始应用于MSI检测。NCCN结直肠癌临床实践指南指出，MSI检测可通过经验证的NGS panel进行，尤其是对于那些需要同时检测RAS/BRAF突变状态的转移性结直肠癌患者。此外，基于外周血循环肿瘤DNA（ctDNA）的MSI（b-MSI）-NGS算法，也为肿瘤组织取样困难或不足的晚期实体瘤患者MSI检测提供新选择。三种检测方法的对比如表1所示。

表1.不同MMR/MSI检测方法的比较

2.RAS和BRAF基因检测

RAS基因是首个被鉴定的癌基因，包括KRAS、NRAS和HRAS三种。RAS基因像“开关”一样，控制着正常细胞的生长增殖。细胞内的RAS基因一旦突变，对应的细胞将脱离机体的正常调控，并一直处于增殖状态，造成肿瘤细胞的疯狂增殖（图1b）。在结直肠癌患者中，以KRAS突变最常见，发生率约为40%，多为高-中分化腺癌和粘液腺癌，常累及淋巴结，预后较差（图1a）。而NRAS的突变率仅约4%，多为老年患者，发生在近端结肠，转移模式与KRAS突变CRC类似，但肺转移相对少见。指南Ⅰ级推荐所有转移性CRC患者，Ⅱ级推荐行CRC根治术患者，应单独或作为下一代测序（NGS）的一部分对KRAS、NRAS和BRAF突变进行肿瘤基因分型。

图1. a.CRC的KRAS突变频率分布；b.突变KRAS蛋白的生化特征

BRAF基因突变在结直肠癌中的发生率为10%~15%，其中BRAF V600E 最多见。BRAF突变结直肠癌的特点为女性多、好发在右半结肠、低分化腺癌、与MSI-H相关。在MSS中预后差，在MSI-H中无预后意义。根据活化机制的不同，BRAF突变可以分为三类（图2），不同突变体对于抑制剂的敏感性不同。

BRAFⅠ类突变最多见，发生在BRAF V600位点（BRAF V600 D/E/K/R/M 突变），在结直肠癌中发生率约为10%，以单体形式存在，可以强烈激活BRAF激酶活性，组成性活化MARK通路，且不依赖于RAS作为单体发出信号，对BRAF和MEK抑制剂敏感。

BRAF Ⅱ 类突变发生在非V600位点（ K601、L597、G464 和 G469等），在结直肠癌中发生率约为2%，以二聚体形式存在，多见于年龄较轻、高分化、男性患者，右半结肠癌少见，多与RAS突变同时发生，预后好于V600突变CRC，中-强活化激酶活性，作为 RAS 非依赖性二聚体激活下游通路，且对BARF抑制剂维莫非尼耐受。

BRAF Ⅲ 类突变（G466、N581、D594 和 D596等），激酶活性低或缺乏激酶活性，为异二聚体，这类突变体依赖RAS并且对依赖ERK反馈的RAS敏感，通过增强其与RAS的结合激活ERK ,并需要分子共存机制使肿瘤中的RAS活化才能起作用，可能对抗EGFR治疗敏感。

图2. BRAF突变类型及MAPK通路活化

3.HER2检测

人表皮生长因子受体2（HER2）属于HER/ERBB家族，其基因定位于染色体17q12-21.32上，属于原癌基因。在结直肠癌中，HER2阳性的发生率为2%~5%。CSCO指南将HER2检测作为转移性结直肠癌手术/活检标本的Ⅲ级推荐。

IHC可检测HER2蛋白过表达，荧光原位杂交（FISH）、显色原位杂交（CISH）和银增强染色原位杂交（SISH）等技术可检测HER2基因扩增。HER2阳性的定义在不同癌种中有所不同，与乳腺癌和胃癌比较，结直肠癌的HER2阳性定义尚未经权威机构认证建立。目前多使用的是Heracles临床研究中的HER2阳性患者筛选标准（表2）。

表2. HER2阳性患者筛选标准

4.NTRK/RET融合检测

NTRK融合突变在结直肠癌中罕见，发生率为0.2%~0.35%，通常富集于MSI-H/MLH1启动子甲基化且RAS/BRAF野生型的结直肠癌中。NTRK基因1、2、3分别编码跨膜酪氨酸激酶受体蛋白TRK-A、TRK-B、TRK-C。部分肿瘤NTRK基因的3‘区和伴侣基因的5‘区形成染色体内或染色体间的融合，而导致相关编码蛋白的异常，进而影响细胞的生长和增殖。针对NTRK融合的抑制剂对结直肠癌具有一定的治疗效果。在CSCO指南中，NTRK融合检测作为转移性结直肠癌的Ⅲ级推荐。

NTRK基因融合的检测方法有多种，pan-TRK的IHC是一种快速、经济的初筛方法，但需要用FISH，RNA测序或NGS等方法进行验证。检测结果大多一致，不一致的情况主要发生在部分NTRK3融合的病例，pan-TRK不表达。中-低分化、实性结构、粘液成分、肿瘤浸润淋巴细胞，都是NTRK融合的结直肠癌组织病理特征。

2024 V1版NCCN指南新增RET融合检测。RET是一种受体酪氨酸激酶，主要通过下游MAPK和PI3K信号通路，在神经和泌尿生殖组织的发育和维持中发挥关键作用。在CRC患者中，激活涉及C末端激酶结构域的RET融合导致RET激酶活性的组成性上调，并随后促进细胞增殖和存活。据报道，最常见的基因融合伴侣包括KIF5B、CCDC6和NCOA4。在CRC中，RET融合发生率比NTRK融合更低。

RET靶向抑制剂塞普替尼被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于携带激活RET融合的实体瘤患者。RET融合的检测同NTRK融合，可以通过多种技术，包括IHC、FISH、PCR和NGS测定。

5.POLE/POLD1突变检测

聚合酶基因POLE和POLD1编码具有校对功能的蛋白质，以识别和纠正DNA复制过程中引入的错误配对碱基。POLE和POLD1的核酸外切酶结构域（ED）内的突变导致校对功能的丧失，而表现为肿瘤超突变表型（TMB>100 mut/Mb）。POLE和POLD1 ED内的胚系突变使患者易患多发性结肠腺瘤和癌，为聚合酶校对相关性息肉病（PPAP）。

在结直肠癌中，POLE突变的频率为2%~8.3%，且体系突变高于胚系，但体细胞POLD1突变极其罕见。POLE突变多见于年轻、男性、右半结肠患者，分期的发生率为Ⅱ>Ⅲ>Ⅳ，预后较好。2024年V1版NCCN指南和我国的CSCO指南均新增了POLE/POLD1检测，并作为转移性结直肠癌的Ⅲ级推荐。

POLE/POLD1突变可用单基因分析（PCR或Sanger测序）进行检测，也可通过大的NGS panel测定，优势是除进行POLE/POLD1测序外，还可检测TMB状况。

专家简介

许晶虹

肿瘤学博士，副主任医师