编者按
在人类抗击癌症的百年历程中，CAR-T细胞疗法如同一枚精准的“生物导弹”，在血液肿瘤领域屡创佳绩。然而，当这一革命性治疗技术面对实体瘤的坚固壁垒时，却屡屡受挫——CAR-T细胞难以深入肿瘤组织、缺乏特异性肿瘤相关抗原，以及肿瘤微环境的免疫抑制作用，令众多科研人员深感无奈。在这片充满挑战的战场上，北京大学肿瘤医院沈琳教授团队的最新研究成果犹如一道曙光，通过单细胞测序技术，揭开了CAR-T细胞在实体瘤中“同药不同效”的神秘面纱。当前该研究成果已于近日发表于Cell子刊iScience上，本文特此进行整理，以飨读者。
研究背景
此前由齐长松教授领衔的一项针对CLDN18.2阳性消化系统肿瘤患者的开放标签单臂Ⅰ期临床试验（NCT03874897）结果显示，CT041 CAR-T治疗的总应答率和疾病控制率分别为48.6%和73.0%，证实了CAR-T疗法在实体瘤中的安全性和有效性。尽管如此，近50%的CLDN18.2阳性患者并未从治疗中获益。因此，探究CAR-T细胞在体内的动态演变及其对治疗效果的影响至关重要。鉴于胃癌转移多位于腹腔、腹膜后淋巴结或腹膜等难以活检的部位，且频繁活检不符合伦理，因此研究者收集了该研究中5例患者的腹水样本，并与患者外周血检测结果相结合进行分析。
研究结果
1.接受CT041治疗患者的临床信息
5例CLDN18.2阳性胃癌患者入组并接受了2.5×108个CAR-T细胞的输注，患者信息如表1所示。根据RECIST 1.1标准，其中1例患者达到部分缓解（PR），其他4例患者疾病进展（PD）。
表1. 患者信息
研究者采集了这5例患者治疗前、治疗后第3天、第7天、第2周、第4周和第8周的血液样本，并检测了CAR拷贝数。结果显示，输注后，CAR-T细胞在外周血中迅速扩增，但7天后逐渐下降（图1A）。细胞因子表达方面，干扰素γ（IFN-γ）和白细胞介素-2（IL-2）等细胞因子随着CAR-T细胞的扩增而增加，达到峰值后减少并逐渐趋于平稳。相比之下，IL-6和IL-8等细胞因子则表现为先升后降的趋势。接受CT041治疗后进行CT扫描显示，达到PR的患者（病例5）腹膜增厚有所减轻，验证了治疗的有效性（图1B）。此外，研究发现治疗前该患者外周血中的细胞毒性T细胞数量多于其他患者，而抑制性T细胞数量少于其他患者，而其他T细胞亚群与治疗效果无关（图1C）。此外，研究者还尽可能多地收集了患者治疗前后的腹水样本，并发现腹水中存在大量CAR-T细胞，其数量显著高于外周血（图1A）。
图1. CAR-T治疗后患者临床指标动态变化（A. 患者腹水[左]和血液[中]中）样本中的CAR基因拷贝数测量值，CT041 治疗 7 天后CAR拷贝数的差异[右]；B.三个时间点腹部增强CT扫描；C.血液中的淋巴细胞亚群）
2.CAR-T细胞疗法后外周血中存在多种细胞类型
为了探究输注的CAR-T细胞的动态变化，研究者从5例患者中采集了15份外周血单个核细胞（PBMC）样本进行单细胞测序（图2A）。研究者鉴定出了九种不同的细胞类型，包括T细胞、B细胞、巨噬细胞等（图2B、2C）。在达到PR的患者中（病例5），NK细胞、T细胞、巨噬细胞和浆细胞在PBMC中的比例在治疗过程中逐渐升高，而其他4例PD患者治疗早期这些细胞的比例有所下降，且血液中中性粒细胞的比例较高（图2D、2E）。
图2. 患者血液样本的细胞分析
3.CCR7在初始T细胞中的表达预示着更好的治疗效果
将血液中NK细胞和T细胞群细分为五个不同的亚群：初始T细胞、CD8+效应T细胞、调节性T细胞、辅助性T细胞和NK细胞（图3A–3C）。治疗后，所有患者各细胞群的比例均有所增加，其中CD8A阳性T细胞增加最为显著。我们还观察到，所有患者外周血中均存在表达CCR7的初始T细胞，且其比例在治疗后逐渐下降，但PR组的比例始终高于PD组（图3D）。疗效较好的病例5在输注前初始T细胞和辅助性T细胞的比例较高，而NK细胞的比例较低。
图3. 患者血液样本的免疫细胞成分特征
4.恶性上皮细胞数量是预测CT041治疗效果的不良预后因素
除了评估患者的外周血情况外，研究者还对腹水状况进行了评价。在这5例患者中，2例（病例1和2）治疗后腹水未缓解，被归类为PD，而其余3例治疗后腹水显著减少，被归类为PR。研究发现，腹水中存在大量CAR-T细胞，且CAR拷贝数显著高于外周血（图1A）。对腹水样本进行单细胞测序分析，共鉴定出13种不同的细胞亚群，包括T细胞、浆细胞、巨噬细胞、浆细胞样树突状细胞和上皮细胞（图4A）。我们观察到，PD组中上皮细胞数量较多，治疗后逐渐减少；而PR组中浆细胞和成纤维细胞的比例高于PD组，T细胞的比例也显著高于PD组。这一观察结果与在血液及腹水样本中所发现的模式相吻合（图2D）。因此，研究者又进一步分析了腹水中的T细胞和上皮细胞，以探索治疗效果的差异。
图4. 患者腹水样本的细胞分析
5.应答者腹水中初始T细胞数量增加
在腹水样本中，我们鉴定出了17种不同的细胞亚群。CD8+效应T细胞主要存在于亚群2、5和8中（图5A）。PD组主要包含C2、C3和C4亚群，而PR组主要包含C1亚群，且该亚群在治疗后逐渐减少（图5B）。CT041输注后，腹水样本中的T细胞不同程度地增加。与血液样本结果相似，PR组腹水样本中初始样T细胞的比例较高，且随着治疗时间的延长而逐渐降低。我们使用RNA测序来鉴定CAR-T细胞及其特异性基因，包括KLRC1和GZMA（图5C）。将我们的数据与血液恶性肿瘤数据集进行比较，以鉴定特异性识别CAR-T细胞的基因，并使用这些基因生成CAR评分统一流形近似和投影（UMAP）。研究结果显示，CD4+（包括亚群3、4、5、9、11和12）和CD8+（包括亚群2、5、7、8和13）T细胞亚群，以及表达NKG7的亚群10中，CAR评分均处于较高水平（图5E）。
图5. 患者腹水样本免疫细胞成分的特征
6.上皮细胞中CLDN18过表达是CT041治疗的良好预后指标
我们将上皮细胞聚类为14个亚群（图6A）。与PR组相比，PD组中的上皮细胞相对丰富（图6B）。聚类1和2中的细胞主要来自PR组，且高表达CLDN18。我们进一步发现，PR组的患者在治疗过程中CLDN18的比例和表达量均较高（图6C、6D）。此外，我们进行了推断拷贝数变异（CNV）分析，发现高表达CLDN18的恶性上皮细胞具有独特的CNV模式。这表明存在一个独特的基因组和转录组特征，可能是CT041临床应答的重要指标。
图6. 患者腹水样本上皮细胞（EC）成分的特征
7.细胞相互作用与CT041疗效的关系
我们研究了腹水中不同细胞类型之间的相互作用。结果表明，与PD组相比，PR组中上皮细胞与巨噬细胞、单核细胞和成纤维细胞之间的相互作用显著增强，而T细胞与巨噬细胞/单核细胞之间的相互作用明显较弱。肿瘤坏死因子（TNF）的相互作用在PR组中高度表达，促进了凋亡和坏死，从而抑制了肿瘤细胞的生长和转移。在PD组中，T细胞与上皮细胞之间的相互作用显著增加，LGALS9和TIM-3的相互作用促进了肿瘤生长和免疫逃逸，使得免疫细胞难以攻击和消除肿瘤细胞（图7B）。我们发现，与PD组相比，PR组中CAR-T细胞与上皮细胞之间的相互作用强烈，这是患者对CT041治疗应答的重要因素（图7C）。
图7. 患者腹水样本中细胞亚群之间的细胞-细胞通信与相互作用
研究分析与总结
截至2022年4月，已有近1000项CAR-T治疗实体瘤的临床试验正在进行中（ClinicalTrials.gov），这表明CAR-T疗法在实体瘤领域的适用范围正在逐步扩大。本研究源于一项临床试验，旨在探讨CT041在患者体内的动态变化。研究发现，体内CAR-T细胞的扩增在治疗后7天达到峰值，且腹水中的CAR-T细胞扩增程度明显高于外周血。治疗前外周血中T细胞比例较高（包括许多细胞毒性T细胞和较少的抑制性T细胞）的患者更有可能从CT041治疗中获益。
不同细胞亚群在血液系统恶性肿瘤的细胞治疗中发挥着重要作用。本研究中，所有患者治疗后均表现出CD8A+效应T细胞比例升高，且外周血中存在表达CCR7的初始样T细胞。具有此类细胞亚群的患者获益持续时间显著更长，且腹水治疗前含有初始样T细胞的患者中CAR-T细胞的细胞毒性功能可能更好。这表明富集特定T细胞亚群可能提高CAR-T疗法的疗效，为更精确的患者选择提供了理论支持。
靶点选择和表达对于CAR-T疗法至关重要，而肿瘤异质性往往限制了实体瘤治疗的疗效。本研究中，尽管患者的胃癌组织样本中CLDN18.2表达一致，但他们的CAR-T治疗疗效却有所不同，且腹水中CLDN18表达更强的患者从治疗中获益更多。因此，选择全身靶基因高表达且均匀的患者至关重要。靶点丢失是影响CAR-T疗法的重要因素。据报道，CD19丢失会导致CAR-T治疗后复发和耐药。频繁采样实体瘤会导致组织损伤，进而使得动态监测体内多个部位的变化变得困难。因此，无创靶向检测有望成为新的解决方案。沈琳教授团队之前研究了一种核探针标记方法24来检测体内多个部位的目标表达，该探针有效解决了这一问题。
肿瘤免疫微环境的作用也不容忽视，它不利于CAR-T细胞浸润到肿瘤组织中。本研究发现，腹水中有大量巨噬细胞浸润，且PR组中上皮细胞与巨噬细胞/单核细胞之间的相互作用显著增强。此外，上皮细胞与成纤维细胞间的相互作用同样显著增强，相反，T细胞与巨噬细胞/单核细胞间的相互作用则明显减弱，这一发现尚未在以往文献中得以报道，这为我们理解CAR-T疗法在实体瘤中的疗效差异提供了新的视角。
总之，本研究动态收集了接受CAR-T细胞治疗的胃癌患者的血液和腹水样本，使用单细胞转录组测序技术分析了CAR-T细胞治疗后血液和腹水样本中的细胞类型及其比例，并探讨了患者之间治疗疗效的差异。腹水上皮细胞中高CLDN18表达是CAR-T治疗后预后良好的指标。相反，腹水上皮细胞中高MYC表达以及肿瘤细胞与T细胞之间的强烈相互作用是不良预后因素。这些发现为未来开发适合CAR-T疗法的患者筛选方法以及提高CAR-T疗法疗效奠定了坚实基础。
参考文献：[1] Ma M, Liu C, Jiang L, Liu D, Zhang P, Tao M, Zhang M, Gong J, Peng Z, Zhang X, Li J, Zheng C, Deng M, Shen L, Qi C. Exploring the therapeutic efficacy difference in claudin18.2-targeted cell therapy revealed by single-cell sequencing. iScience. 2025 Jan 7;28(2):111768.
