编者按：癌症的发生源于遗传突变的积累。尽管二维（2D）和三维（3D）体外培养模型在癌症研究中发挥了重要作用，能够描绘增殖、运动、侵袭等简单的癌细胞行为，但这些模型仍难以模拟涉及多种细胞和组织的复杂过程。因此，现有模型无法完全再现癌症的复杂性，结直肠癌等癌症研究仍依赖于高成本且具有伦理争议的动物实验。

近日，洛桑联邦理工学院（EPFL）的研究人员在Nature [IF:33.1]上发表了题为《Spatiotemporally resolved colorectal oncogenesis in mini-colons ex vivo》的文章。该研究开发了一种新型的3D类器官培养系统——微型结肠（mini-colon）。这一技术不仅能够精确模拟结直肠癌的恶性转化过程，还能捕捉肿瘤内部及不同肿瘤之间的多样性，重现结直肠癌的关键病理生理特征。通过调整细胞内外的多种参数，新型微型结肠为探索致癌因素和潜在药物靶点提供了新平台，有望推进对癌症发生机制的理解，并加速新疗法的研发。

01

新型微型结肠诱导肿瘤发生实验

为了实现对结直肠癌（CRC）转化过程的精准调控，研究人员首先开发了一种对强力霉素敏感的蓝光调节Cre系统——OptoCre，并将其应用于健康结肠类器官中，以实现致癌DNA重组的精确时空调控[1]。接着，研究人员结合3D类器官培养技术、微加工、光遗传学与组织工程方法，开发了新型微型结肠模型。此模型能够在体外高度可控地模拟肿瘤的发生和发展，相比传统类器官，它克服了在癌症演化复杂性方面的限制，并通过蓝光照射精确触发和调控肿瘤形成，实现对结直肠癌发展过程中细胞行为的长期、非侵入式监测。
在初步实验中，OptoCre系统在传统类器官培养条件下的表现显示，蓝光和多西环素的存在能有效诱导DNA重组。通过剂量优化，研究实现了高效重组并减少了背景激活。进一步实验显示，在去除培养基中的生长因子后，只有激活OptoCre的细胞才能继续生长，这验证了AKP突变结肠类器官的致癌特征。
接下来，研究人员利用支架引导的微流体技术构建了一个稳定的“迷你结肠”模型。该模型由单层结肠上皮细胞组成，空间上排列成隐窝状和管腔状结构，模拟了体内结肠的组织结构。与传统类器官相比，这种“迷你结肠”模型具有更长的培养周期，且无需定期传代或破坏组织。通过该系统，研究人员能够通过蓝光照明实现致癌重组的精确控制。
研究发现，即使仅有不到0.5%的细胞发生突变，这些细胞在短暂静止期后仍能迅速分裂，最终形成肿瘤结构。这些肿瘤从息肉样结构逐渐演变为成熟肿瘤，模拟了体内肿瘤的发生过程。免疫染色分析显示，这些肿瘤起源于上皮基部的CD44+细胞，表明这些细胞是体内的癌症干细胞（见图1）。这些肿瘤表现出高度的异质性，包括不同的分化状态，类似于体内观察到的情况。移植实验进一步验证了这些肿瘤的致癌性质，并在免疫缺陷小鼠体内形成了与真实肿瘤相似的肿瘤。

02

微型结肠肿瘤单细胞转录组学的精准洞察

为了深入探究微型结肠的克隆身份，研究人员采用了先进的单细胞转录组测序技术，并结合遗传条形码系统，以保留每个细胞的克隆信息。这一技术革新使研究者能够深入剖析细胞间的遗传变异与转录表达模式，为理解肿瘤的起源与演进提供了前所未有的视角。转录标记分析发现，微型结肠主要由八种细胞类型构成，这些细胞进一步划分为未分化、吸收性和分泌性谱系。未分化细胞群包括干细胞（Lgr5+）、积极增殖细胞（Mki67+）和祖细胞（Sox9+Cd44+），这些细胞共同构成了肿瘤发生的重要细胞基础[2]。
成熟的吸收性结肠细胞占据了微型结肠的大部分，根据分区标志物（如Aldob、Iqgap2和Clca4a）的不同表达，可细分为底部、中部和顶部细胞。此外，杯状细胞（Muc2+）和肠内分泌细胞（Neurod1+）组成了分泌室（见图2），对维持肠道稳态至关重要。

利用遗传条形码系统，研究成功鉴定了83个克隆群体，并筛选去除了小型克隆（<5个细胞）。进一步分析显示，携带Apc和Trp53突变的细胞形成了明显的肿瘤克隆群（18个分类），与健康对照组（16个分类）显著区分。健康克隆群体中的未分化细胞比例约为18%，而肿瘤克隆则主要由未分化细胞构成（约92%），伴随稀疏的吸收性和分泌性细胞。这一发现强调了未分化细胞在肿瘤发生中的核心作用[3,4]。
单克隆肿瘤内部的结构分析揭示了细胞的非均一集合，这些细胞表现出不同的增殖、干性和分化标志物。这种肿瘤内异质性不仅反映了肿瘤的复杂性，也与免疫染色数据相吻合，进一步支持了肿瘤作为一个由多种细胞类型组成的动态生态系统的观点。
通过转录差异分析，研究发现Gpx2（谷胱甘肽过氧化物酶）与微型结肠癌细胞的干性潜力密切相关。GPX2蛋白在肿瘤基底细胞中的特异性富集，提示其在肿瘤恶性转化中的潜在作用。此外，研究还观察到不同肿瘤克隆间存在显著的转录谱差异，这些差异可能与肿瘤生态位的内在因素和/或环境因素相关，从而导致多种肿瘤亚型的形成。

03

小结

研究成功开发的新型微型结肠系统在癌症研究领域取得了显著进展。该系统能够精确模拟结直肠癌的恶性转化过程，并捕捉肿瘤内部及不同肿瘤之间的多样性，重现结直肠癌的关键病理生理特征。总体而言，新型微型结肠类器官系统为结直肠癌研究提供了一个强大的平台，有望推进对癌症发生机制的理解，并加速新疗法的研发进程。这一成功应用不仅为癌症研究开辟了新的道路，也为未来精准医疗的发展奠定了坚实基础。

参考文献

1、Lorenzo-Martín LF, Hübscher T, Bowler AD, Broguiere N, Langer J, Tillard L, Nikolaev M, Radtke F, Lutolf MP. Spatiotemporally resolved colorectal oncogenesis in mini-colons ex vivo. Nature. 2024 May;629(8011):450-457. doi: 10.1038/s41586-024-07330-2. Epub 2024 Apr 24. PMID: 38658753; PMCID: PMC11078756.2、Biddy, B. A. et al. Single-cell mapping of lineage and identity in direct reprogramming.Nature 564, 219–224 (2018).3、Becker, W. R. et al. Single-cell analyses define a continuum of cell state and compositionchanges in the malignant transformation of polyps to colorectal cancer. Nat. Genet. 54,985–995 (2022).4. Snippert, H. J. et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competitionbetween symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell 143, 134–144 (2010).

0